Dithiothreitol (DTT) er et almindeligt anvendt reduktionsmiddel, også kendt som det nye grønne tilsætningsstof.Det er en lille molekylær organisk forbindelse med to mercaptangrupper (-SH).På grund af dets reducerende egenskaber og stabilitet er DTT meget brugt i biokemi og molekylærbiologiske eksperimenter.
DTTs hovedrolle er at reducere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler.Disulfidbindingen er en vigtig del af proteinfoldning og stabilitet, men under visse eksperimentelle betingelser, såsom reducerbar SDS-PAGE-analyse, proteinrekombination og foldning, er det nødvendigt at reducere disulfidbindingen til to thiolgrupper for at optrevle den rumlige struktur af proteinet.DTT kan reagere med disulfidbindinger for at reducere dem til mercaptangrupper og dermed åbne op for proteinets rumlige struktur og gøre det nemt at analysere og manipulere.
DTT kan også bruges til at beskytte enzymaktivitet og stabilitet.I nogle enzymkatalyserede reaktioner kan enzymets aktivitet blive reduceret af oxidanten.DTT kan reagere med oxidanter for at reducere dem til harmløse stoffer og derved beskytte enzymets aktivitet og stabilitet.
Sammenlignet med traditionelle reduktionsmidler såsom β-mercaptoethanol (β-ME), anses DTT for at være et sikrere og mere stabilt reduktionsmiddel.Det er ikke kun stabilt i vandig opløsning, men bevarer også sine reducerende egenskaber under høje temperaturer og syre-base forhold.
Brugen af DTT er forholdsvis enkel.Generelt opløses DTT i en passende buffer og tilsættes derefter til det eksperimentelle system.Den optimale koncentration af DTT skal bestemmes i henhold til det specifikke eksperiment og bruges generelt i området 0,1-1 mM.Lavere koncentrationer kan reducere negative virkninger på cellevækst og kan reducere cytotoksicitet på grund af overekspression af målproteiner.Højere koncentrationer kan forårsage overdreven cellemetabolisk belastning, hvilket påvirker cellevækst og ekspressionseffektivitet.
Måden at bestemme den optimale koncentration på kan være at evaluere ekspressionsniveauet af målproteinet ved at udføre IPTG-induktionstest ved forskellige koncentrationer.Småskala kulturtests kan udføres under anvendelse af en række IPTG-koncentrationer (f.eks. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM osv.), og ekspressionseffekten ved forskellige koncentrationer kan evalueres ved at detektere ekspressionsniveauet af målproteinet (f.eks. Western blot eller fluorescensdetektion).Ifølge de eksperimentelle resultater blev koncentrationen med den bedste ekspressionseffekt valgt som den optimale koncentration.
Derudover kan du også henvise til den relevante litteratur eller erfaringer fra andre laboratorier for at forstå det almindeligt anvendte IPTG-koncentrationsområde under lignende eksperimentelle forhold og derefter optimere og justere i henhold til de eksperimentelle behov.
Det er vigtigt at bemærke, at den optimale koncentration kan variere afhængigt af forskellige ekspressionssystemer, målproteiner og eksperimentelle forhold, så det er bedst at optimere fra sag til sag.
Sammenfattende er DTT et almindeligt anvendt reduktionsmiddel, der kan bruges til at reducere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler og til at beskytte enzymaktivitet og stabilitet.Det har været meget brugt i biokemi og molekylærbiologiske eksperimenter.
Indlægstid: 28. september 2023