Dithiothreitol (DTT) er et almindeligt anvendt reduktionsmiddel, også kendt som det nye grønne additiv. Det er en lille molekylær organisk forbindelse med to mercaptangrupper (-SH). På grund af dens reducerende egenskaber og stabilitet anvendes DTT i vid udstrækning i biokemiske og molekylærbiologiske eksperimenter.
DTT's hovedrolle er at reducere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler. Disulfidbindingen er en vigtig del af proteinfoldning og -stabilitet, men under visse eksperimentelle forhold, såsom reducerbar SDS-PAGE-analyse, proteinrekombination og -foldning, er det nødvendigt at reducere disulfidbindingen til to thiolgrupper for at optrævle proteinets rumlige struktur. DTT kan reagere med disulfidbindinger for at reducere dem til mercaptangrupper, hvorved proteinets rumlige struktur åbnes op og det bliver nemt at analysere og manipulere.
DTT kan også bruges til at beskytte enzymaktivitet og stabilitet. I nogle enzymkatalyserede reaktioner kan enzymets aktivitet reduceres af oxidanten. DTT kan reagere med oxidanter for at reducere dem til harmløse stoffer og derved beskytte enzymets aktivitet og stabilitet.
Sammenlignet med traditionelle reduktionsmidler såsom β-mercaptoethanol (β-ME) betragtes DTT som et sikrere og mere stabilt reduktionsmiddel. Det er ikke kun stabilt i vandig opløsning, men bevarer også sine reducerende egenskaber under høje temperaturer og syre-baseforhold.
Brugen af DTT er relativt enkel. Generelt opløses DTT i en passende buffer og tilsættes derefter til forsøgssystemet. Den optimale koncentration af DTT skal bestemmes i henhold til det specifikke eksperiment og anvendes generelt i området 0,1-1 mM. Lavere koncentrationer kan reducere negative virkninger på cellevækst og kan reducere cytotoksicitet på grund af overekspression af målproteiner. Højere koncentrationer kan forårsage overdreven cellemetabolisk byrde, hvilket påvirker cellevækst og ekspressionseffektivitet.
Den optimale koncentration kan bestemmes ved at evaluere ekspressionsniveauet af målproteinet ved at udføre IPTG-induktionstests ved forskellige koncentrationer. Kulturtests i lille skala kan udføres ved hjælp af en række IPTG-koncentrationer (f.eks. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM osv.), og ekspressionseffekten ved forskellige koncentrationer kan evalueres ved at detektere ekspressionsniveauet af målproteinet (f.eks. Western blot eller fluorescensdetektion). Ifølge de eksperimentelle resultater blev koncentrationen med den bedste ekspressionseffekt valgt som den optimale koncentration.
Derudover kan du også henvise til relevant litteratur eller andre laboratoriers erfaringer for at forstå det almindeligt anvendte IPTG-koncentrationsområde under lignende forsøgsforhold og derefter optimere og justere i henhold til de eksperimentelle behov.
Det er vigtigt at bemærke, at den optimale koncentration kan variere afhængigt af forskellige ekspressionssystemer, målproteiner og forsøgsbetingelser, så det er bedst at optimere fra sag til sag.
Kort sagt er DTT et almindeligt anvendt reduktionsmiddel, der kan bruges til at reducere disulfidbindinger i proteiner og andre biomolekyler og til at beskytte enzymaktivitet og stabilitet. Det har været meget anvendt i biokemiske og molekylærbiologiske eksperimenter.
Opslagstidspunkt: 28. september 2023