Bæltet og vejen: Samarbejde, Harmoni og Win-Win
nyheder

nyheder

Er koncentrationen af ​​induceren IPTG CAS:367-93-1 jo højere jo bedre?Hvordan bestemmer man den optimale koncentration?

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactosid) er en analog af β-galactosidase-substrat, som er meget inducerbart.Under induktion af IPTG kan induceren danne et kompleks med repressorproteinet, således at konformationen af ​​repressorproteinet ændres, så det ikke kan kombineres med målgenet, og målgenet udtrykkes effektivt.Så hvordan skal koncentrationen af ​​IPTG bestemmes under forsøget?Er jo større jo bedre?

Lad os først forstå princippet om IPTG-induktion: E. colis lactose-operon (element) indeholder tre strukturelle gener, Z, Y og A, som koder for henholdsvis β-galactosidase, permease og acetyltransferase.lacZ hydrolyserer lactose til glucose og galactose eller til allo-lactose;lacY tillader laktose i miljøet at passere gennem cellemembranen og trænger ind i cellen;lacA overfører acetylgruppen fra acetyl-CoA til β-galactosid, hvilket involverer fjernelse af toksisk effekt.Derudover er der en operationssekvens O, en startsekvens P og et regulatorisk gen I. I-genkoden er et repressorprotein, der kan binde sig til positionen O i operatorsekvensen, således at operonet (meta) undertrykkes og slukket.Der er også et bindingssted for katabolisk genaktivatorprotein-CAP-bindingssted opstrøms for den initierende sekvens P. P-sekvensen, O-sekvensen og CAP-bindingsstedet udgør tilsammen den regulatoriske region af lac-operonen.De kodende gener for de tre enzymer reguleres af den samme regulatoriske region for at opnå den koordinerede ekspression af genprodukter.

I mangel af laktose er lac-operonen (meta) i en tilstand af undertrykkelse.På dette tidspunkt binder lac-repressoren udtrykt af I-sekvensen under kontrol af PI-promotorsekvensen til O-sekvensen, hvilket forhindrer RNA-polymerase i at binde til P-sekvensen og inhiberer transkriptionsinitiering;når laktose er til stede, kan lac operon (meta) induceres. I dette operon (meta) system er den egentlige inducer ikke selve laktose.Lactose kommer ind i cellen og katalyseres af β-galactosidase for at blive omdannet til allolactose.Sidstnævnte, som et inducermolekyle, binder sig til repressorproteinet og ændrer proteinkonformationen, hvilket fører til dissociationen af ​​repressorproteinet fra O-sekvensen og transkription.Isopropylthiogalactosid (IPTG) har samme effekt som allolactose.Det er en meget kraftig inducer, som ikke metaboliseres af bakterier og er meget stabil, så den bruges meget i laboratorier.

Sådan bestemmes den optimale koncentration
Sådan bestemmes den optimale koncentration1

Hvordan bestemmes den optimale koncentration af IPTG?Tag E. coli som eksempel.
Den gensplejsede E. coli BL21-stamme indeholdende den positive rekombinante pGEX (CGRP/msCT) blev inokuleret i LB flydende medium indeholdende 50μg·mL-1 Amp og dyrket natten over ved 37°C.Ovenstående kultur blev inokuleret i 10 flasker 50mL frisk LB flydende medium indeholdende 50μg·mL-1 Amp i et forhold på 1:100 for ekspansionskultur, og når OD600 værdien var 0,6~0,8, blev IPTG tilsat til slutkoncentrationen.Det er 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1.Efter induktion ved samme temperatur og samme tid blev 1 ml af bakterieopløsningen taget fra den, og bakteriecellerne blev opsamlet ved centrifugering og underkastet SDS-PAGE for at analysere indflydelsen af ​​forskellige IPTG-koncentrationer på proteinekspression, og derefter vælg IPTG-koncentrationen med den største proteinekspression.

Efter forsøg vil det vise sig, at koncentrationen af ​​IPTG ikke er så stor som muligt.Dette skyldes, at IPTG har en vis toksicitet over for bakterier.Overskridelse af koncentrationen vil også dræbe cellen;og generelt håber vi, at jo mere opløseligt protein der udtrykkes i cellen, jo bedre, men i mange tilfælde, når koncentrationen af ​​IPTG er for høj, vil der blive dannet en stor mængde inklusion.Krop, men mængden af ​​opløseligt protein faldt.Derfor er den bedst egnede IPTG-koncentration ofte ikke jo større, jo bedre, men jo lavere koncentration.

Formålet med induktion og dyrkning af gensplejsede stammer er at øge udbyttet af målproteinet og reducere omkostningerne.Ekspressionen af ​​målgenet påvirkes ikke kun af stammens egne faktorer og ekspressionsplasmidet, men også af andre eksterne forhold, såsom koncentrationen af ​​induceren, induktionstemperaturen og induktionstiden.Derfor er det generelt, før et ukendt protein udtrykkes og oprenses, bedst at studere induktionstid, temperatur og IPTG-koncentration for at vælge de passende betingelser og opnå de bedste eksperimentelle resultater.


Indlægstid: 31. december 2021