IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactosid) er en analog af β-galactosidasesubstratet, som er meget inducerbar. Under induktion af IPTG kan induceren danne et kompleks med repressorproteinet, således at repressorproteinets konformation ændres, så det ikke kan kombineres med målgenet, og målgenet udtrykkes effektivt. Så hvordan skal koncentrationen af IPTG bestemmes under eksperimentet? Er det bedre, jo større?
Lad os først forstå princippet bag IPTG-induktion: E. colis laktoseoperon (element) indeholder tre strukturelle gener, Z, Y og A, som koder for henholdsvis β-galactosidase, permease og acetyltransferase. lacZ hydrolyserer laktose til glukose og galactose eller til allolaktose; lacY tillader laktose i miljøet at passere gennem cellemembranen og trænge ind i cellen; lacA overfører acetylgruppen fra acetyl-CoA til β-galactosid, hvilket involverer fjernelse af den toksiske effekt. Derudover er der en operationssekvens O, en startsekvens P og et regulatorisk gen I. I-genkoden er et repressorprotein, der kan binde til position O i operatorsekvensen, således at operonen (meta) undertrykkes og slukkes. Der er også et bindingssted for det katabolske genaktivatorprotein - CAP-bindingsstedet opstrøms for den initierende sekvens P. P-sekvensen, O-sekvensen og CAP-bindingsstedet udgør tilsammen den regulatoriske region af lac-operonen. De kodende gener for de tre enzymer reguleres af den samme regulatoriske region for at opnå koordineret ekspression af genprodukter.
I fravær af laktose er lac-operonen (meta) i en repressionstilstand. På dette tidspunkt binder lac-repressoren udtrykt af I-sekvensen under kontrol af PI-promotorsekvensen sig til O-sekvensen, hvilket forhindrer RNA-polymerase i at binde sig til P-sekvensen og hæmmer transkriptionsinitiering; når laktose er til stede, kan lac-operonen (meta) induceres. I dette operon (meta)-system er den egentlige inducer ikke laktose i sig selv. Laktose trænger ind i cellen og katalyseres af β-galactosidase, der omdannes til allolactose. Sidstnævnte binder sig som et inducermolekyle til repressorproteinet og ændrer proteinkonformationen, hvilket fører til dissociation af repressorproteinet fra O-sekvensen og transkription. Isopropylthiogalactosid (IPTG) har samme effekt som allolactose. Det er en meget kraftig inducer, som ikke metaboliseres af bakterier og er meget stabil, så den anvendes i vid udstrækning i laboratorier.
Hvordan bestemmer man den optimale koncentration af IPTG? Tag E. coli som et eksempel.
Den genetisk modificerede E. coli BL21-stamme indeholdende den positive rekombinante pGEX (CGRP/msCT) blev inokuleret i LB-væskemedium indeholdende 50 μg·mL-1 Amp og dyrket natten over ved 37°C. Ovenstående kultur blev inokuleret i 10 flasker med 50 ml frisk LB-væskemedium indeholdende 50 μg·mL-1 Amp i et forhold på 1:100 til ekspansionskultur, og da OD600-værdien var 0,6~0,8, blev IPTG tilsat den endelige koncentration. Den er 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Efter induktion ved samme temperatur og samme tid blev 1 ml af bakterieopløsningen udtaget derfra, og bakteriecellerne blev opsamlet ved centrifugering og underkastet SDS-PAGE for at analysere indflydelsen af forskellige IPTG-koncentrationer på proteinekspression, og derefter vælge IPTG-koncentrationen med den største proteinekspression.
Efter eksperimenter vil det vise sig, at koncentrationen af IPTG ikke er så høj som muligt. Dette skyldes, at IPTG har en vis toksicitet for bakterier. Overskridelse af koncentrationen vil også dræbe cellen; og generelt håber vi, at jo mere opløseligt protein der udtrykkes i cellen, jo bedre, men i mange tilfælde, når koncentrationen af IPTG er for høj, vil der dannes en stor mængde inklusion. Kroppen, men mængden af opløseligt protein reduceres. Derfor er den mest passende IPTG-koncentration ofte ikke jo større jo bedre, men jo lavere koncentrationen er.
Formålet med induktion og dyrkning af genetisk modificerede stammer er at øge udbyttet af målproteinet og reducere omkostningerne. Ekspressionen af målgenet påvirkes ikke kun af stammens egne faktorer og ekspressionsplasmidet, men også af andre eksterne forhold, såsom koncentrationen af induktoren, induktionstemperaturen og induktionstiden. Derfor er det generelt bedst at undersøge induktionstiden, temperaturen og IPTG-koncentrationen, før et ukendt protein udtrykkes og oprenses, for at vælge de passende betingelser og opnå de bedste eksperimentelle resultater.
Opslagstidspunkt: 31. dec. 2021